原核轉錄組測序是指利用高通量測序技術對原核生物的轉錄本（mRNA和非編碼RNA）進行測序，全面快速地獲取特定微生物在特定狀態(tài)下的所有轉錄本的信息。通過轉錄組測序不僅能夠對mRNA進行表達定量分析，分析差異表達基因及其相應功能，同時還能夠分析Non-coding RNA（sRNAs），揭示微生物不同表型形成的分子調控機制和功能。 由于原核生物mRNA不具有polyA尾結構，需要采用去除rRNA的方法構建文庫，聯川生物針對不同的研究物種采取有效的方法去除rRNA，保證數據質量。
技術優(yōu)勢
磁珠法去除rRNA，rRNA去除效率好，數據質量高
采用鏈特異性建庫，建庫穩(wěn)定性好
除進行mRNA定量分析外，還可以進行反義轉錄本預測，基因結構分析等；
可以同時進行mRNA和sRNA分析，sRNA 預測，變異分析等
技術路線
分析內容
樣本類型
微生物菌體（≥ 5×107），組織，環(huán)境樣品，總RNA等
建議總RNA起始量：≥3μg；濃度：≥70 ng/μL。
Q：原核生物與真核生物在進行轉錄組測序文庫構建時有什么區(qū)別？A：在原核生物中，mRNA只占全部RNA的1-5%，其余絕大部分是核糖體RNA（rRNA），因此在開展轉錄組測序前，需先將mRNA純化。然而，原核生物mRNA不具有polyA結構，無法直接利用oligoT將mRNA純化出來，如果直接用total RNA進行測序，數據質量將非常差，大部分序列都來自rRNA。
提高原核生物中mRNA的量，最主要的方式是去除total RNA中的rRNA。在建庫過程中顯加入磁珠將rRNA吸附，過濾掉磁珠后的體系再進行下游建庫。
全基因組測序和轉錄組揭示藍藻對青藏高原極端氣候的適應機制
研究背景
青藏高原不僅是世界上最高且規(guī)模最大的高原，同時具有包括極大的溫差、低氧濃度、低壓、強紫外線輻射以及狂風等在內的極端環(huán)境，且有許多獨特的環(huán)境，包括雪山、鹽水湖泊及干旱沙 漠等，具有極高的生物多樣性，為研究適應性進化提供了一個理想的天然實驗室。藍藻是最早的光合放氧生物，幾乎可以將所有緯度范圍的地區(qū)作為棲息地，對于全球生態(tài)具有相當大的重要 性；藍藻可以適應可變滲透壓、持續(xù)低溫及強烈的紫外線輻射等環(huán)境。
研究結果
青藏高原藍藻基因組序列是 5.9 Mb，具有 39.2%的 G+C 含量，總共包括5362 個 CDS。系統進化樹表明，這一菌株屬于 Trichormus 和 Anabaena 集群。T. sp. NMC-1 和6個近 緣種之間的基因組對比顯示，在 T. sp. NMC-1 基因組中，功能未知的基因占據了更高的比例(28.12%)。
轉錄組分析發(fā)現表達顯著上調的基因參與膜生物起源、翻譯、核糖體結構和生物起源、次生代謝產物生物合成、氨基酸運輸和代謝、防御機制等過程；相比之下，下調基因主要參與信 號轉導機制、膜生物起源及能源生產和轉換。進一步的分析表明，CheY-like 基因、胞外多糖和類菌胞素氨基酸樣的氨基酸，可能在極端環(huán)境的適應性中扮演重要的角色。
研究結論
青藏高原引起極端環(huán)境而具有最高的生物多樣性，為研究適應性進化提供了一個理想的天然實驗室。該研究繪制了青藏高原藍藻的基因組序列草圖，并在低溫下進行了全轉錄組測序，以探討 T. sp. NMC-1 適應特殊環(huán)境的遺傳學機制。明顯正向選擇的、擴張純正群的和差異表達的一些基因參與信號轉導、細胞壁/膜生物起源、次生代謝產物的生物合成、能源生產和轉換，旨在闡 述特殊的適應特征。這些結果表明，藍藻對青藏高原極端環(huán)境的適應性背后，有著復雜的遺傳學機制。
參考文獻
Qin Q, Huang Y, Ji Q, et al. The genome and transcriptome ofTrichormussp. NMC-1: insights into adaptation to extreme environments on the Qinghai-Tibet Plateau:[J]. Scientific Reports, 2016, 6:29404.
差異基因 GO 富集 DAG 圖有向無環(huán)圖(Directed Acyclic Graph， DAG)為差異基因GO富集分析結果的圖形化展示方式。圖中的分支代表包含關系，從上至下所定義的功能范圍越來越小，一般選取GO富集分析的結果前10位作為有向無環(huán)圖的主節(jié)點，并通過包含關系，將相關聯的GO Term一起展示，顏色的深淺代表富集程度。
差異基因表達模式聚類將有顯著差異的基因/轉錄本進行表達模式聚類分析，采用距離計算算法： 樣本間為spearman，基因間為pearson，采用的聚類方法為hcluster（complete算法）。
sRNA 預測原核生物中，長度在 50～500nt 的非編碼 RNA 通常定義為小 RNA(small RNA, sRNA)。用 Rockhopper 軟件 發(fā)現新轉錄本， 通過將其與 Uniport 數據庫進行注釋，將未注釋到數據庫的轉錄本作為潛在的非編碼 sRNA。用RNAFold 分析其莖環(huán)結構，進行 二級結構預測。
